在帕多瓦大学当教授的时候，维萨里全力以赴地进行他的解剖学研究，他在解剖的过程中发现了盖伦的许多错误，且在整理盖伦原著的时候，找到了盖伦错误的来源。盖伦为什么会认为人的大腿骨是弯的呢？原来盖伦把解剖狗的结论用到了人身上。其它错误有的来自对猩猩的解剖，有的来自对猴子的解剖。因此，维萨里认为必须重新观察人体，不能依赖盖伦的简单的结论。
在帕多瓦，维萨里仍然经常进行解剖学表演，并一边解剖，一边指出盖伦的结论的错误。有一次进行解剖表演时，仅骨骼一项就指出盖伦的200多处错误。中世纪以来，外科医生和医学专家们只是讲盖伦的理论，根本不亲自动手术，因此也从不亲自作解剖，手术一般由理发师做，这在今天肯定会把所有需要作手术的病人全吓跑了。至于解剖尸体就更不去干了，而维萨里在解剖时从来不需要什么助手帮助，他总是亲自动手。由于他的实际经验丰富，解剖课上得生动活泼，并且确实能学到许多东西，因此他很快就在学术界享有了极高的声誉。校外及其它各界人士来听课的人也非常多，常常有几百名听众到课堂上听他讲课，看他作解剖演示，为了改进解剖技术，维萨里还引进许多新的解剖工具，有些是他亲自设计的，有些是向工匠们学来的。
维萨里在大学里进行的重要改革就是改革了解剖学的上课方法。在维萨里以前教师从不动刀解剖，对这一点维萨里进行了辛辣的讽刺与嘲笑：无知的助手在解剖尸体，而有学问的教授则像个寒鸦，高高地栖息在椅子上，极端傲慢地呱呱讲着他自己从来也没有亲自了解的东西。维萨里认为，解剖学的课程就这样误人子弟地进行着，以致一个医学院的学生从一个屠夫那儿也比从那些傻瓜教授那儿学到的东西多。
尽管维萨里的解剖学课程深受学生和其它热爱科学的人们的欢迎，但是却遭到了教会、神学家以及那些保守的教授们的一致反对。原因在于他的解剖学结论不符合基督教的教义。根据《圣经》上的说法，男子的肋骨应该比女子少一根，因为夏娃是用亚当的一根肋骨造成的。另外，教会认为在人的心脏中有一根所谓的”不可毁灭的复活骨“，而维萨里却明确指出，这只是一个神学问题，与科学无关。从解剖观察中看出：人的心脏中根本没有这根”复活骨“。
在帕多瓦大学任教期间，维萨里用了四年的时间完成了他的著名的解剖学巨著《人体的构造》。
1507～1542年，维萨里在帕多瓦大学用了四年时间，完成了《人体的构造》这部七卷本的解剖学巨著。1543年6月这本书正式出版，负责出版这本书的是巴赛尔的奥瑞阿斯——一个曾因为出版拉丁版的《古兰经》被关进牢狱的勇士。当时出版《人体的构造》也同样担负着很大的风险。
《人体的构造》出版问世，标志着近代医学的开端。这部解剖学巨著是以一篇保卫科学健康发展的前言作为开头的。在这个前言中，维萨里提醒人们：要注意来自阻碍科学和艺术发展的障碍的危险。他虽然没有明确指出危险的来源，但却通过对帕多瓦大学、威尼斯参议院和查理皇帝的赞扬，表明了他对这些支持学术活动者的感激之情。
《人体的构造》一书中有278幅精美的木刻插图，插图所画的人体都有着十分生动的姿态：有的拿着劳动工具，有的摆成各种动作。画面上还衬有明快的大自然的背景，完全改变了以往的解剖图的枯燥的形式。这些插图不仅反映了文艺复兴时期生动、活泼的对生活乐观主义情趣，也反映了维萨里不仅仅是一位解剖学家，同时也是一位艺术大师，是那个时代的多才多艺的伟人。
维萨里的工作，科学地揭示了人体的结构。在这之前，人们对人体的知识还是一片模糊，正是维萨里在他的《人体的构造》中正确地描述了人体的结构，探索了这些结构的准确部位，以及这些结构在人体活动中的功能，才有了现代的医学。因此，后人称赞维萨里的伟大贡献时形象地告诉我们，解剖学资料对于医生就象地图对于旅行家一样。维萨里建立了真实的人体解剖学，把人体的第一幅地图交给了医生们，根据这幅人体的地图，人们才建立起今天的医学科学。
维萨里在生理学方面的贡献要小一些。他并没有完全突破盖伦的理论，取得什么重大进步。但是由于他正确地揭示了人体的构造，因此为生理学的研究准备了充分的条件，开创了生理学的研究方向。以后，哈维就是在维萨里研究的基础上取得了重大突破的。
维萨里的《人体的构造》及书中的插图在解剖学上是占有极其重要的地位的。第一次出版后，从1543年—1782年至少重印、再版了25次以上。甚至维萨里还在世的时候就被一再的抄袭和重印。他去世以后，又被译成了俄、英、德、法等多种文字，在整个欧洲引起了很大的反响，以致俄国著名医学家、生理学家巴甫洛夫称维萨里的《人体的构造》是人类近代史上第一部人体解剖学。他并不仅仅重复古代权威的指示和意见，而是依靠自己的深入研究所完成的。
