东汉时期，玉门关入西域的路线，走向明显改变，究其原因，乃政治形势的变化所促成。《后汉书西域传》云：“自建武至于延光，西域三绝三通。”随着汉王朝内部政治斗争的起伏和国力的强弱，汉与匈奴在西域继续进行着时断时续的斗争。争夺的焦点，仍是对以车师前国为中心的吐鲁番盆地的控制，并扩大至以伊吾为中心的哈密盆地。早在西汉末，汉对西域控制的丧失，即由车师开始。平帝元始中(公元1~5年），车师后王姑句叛入匈奴。王莽始建国二年(公元10年），车师后国辅国侯狐兰支再“举国亡降匈奴”。不久，史陈良、终带等杀戊己校尉刁护，又叛降匈奴。自此，车师前、后国地尽失。王莽天凤三年(公元16年），焉耆诈降，袭杀五威将王骏，戊己校尉郭钦引兵而还，西域都护李崇退保龟兹。后数年死，“西域因绝”。经50余年后，东汉对西域的经营，自对伊吾的控制开始。明帝永平十六年(公元73年），“命将帅，北征匈奴，取伊吾卢地，置宜禾都尉以屯田，遂通西域”。“明年，始置都护、戊己校尉”。明帝死后，焉耆、龟兹趁机“攻没都护陈睦”，匈奴、车师则围攻戊己校尉。章帝建初元年(公元76年），“乃迎还戊己校尉，不复遣都护。二年，复罢屯田伊吾，匈奴因遣兵守伊吾地”。和帝永元二年(公元90年），大将军窦宪遗副校尉阎架“掩击伊吾，破之”。“三年，班超遂定西域，因以超为都护，居龟兹。复置戊己校尉，“居车师前部高昌壁，又置戊部候，居车师后部候城，相去五百里”。和帝死后，“西域背畔”。安帝永初元年(公元107年），“诏罢都护”。延光二年(公元123年），以班勇为西域长史，西屯柳中，“勇遂破平车师”。顺帝永建六年(公元131年），“帝以伊吾旧膏腴之地，傍近西域，匈奴资之，以为抄暴，复令开设屯田如永元时事，置伊吾司马一人”。此时，匈奴已日益衰落，残留于天山之北的势力，仍不时侵掠伊吾与车师后部。桓帝元嘉元年(公元151年），匈奴呼衍王攻伊吾屯城，不果。从此，汉与匈奴在车师、伊吾的争夺，再不见于史籍。综上所述，东汉以来，由于匈奴势力的日渐衰落，匈奴对西域、尤其对车师、伊吾的控制不断削弱，东汉王朝具备了重新选择进入西域道路的可能。
如前所述，西汉时期，玉门关经楼兰至渠犁的道路，沿途自然条件极为严酷。但是，库鲁克塔格山脉以北的地理环境，对中原人西域的交通，则相对较为有利。吐鲁番-哈密盆地为天山山间陷落盆地，北为博格达山和哈尔里克山，南为觉罗塔格山和噶顺戈壁，西为乌肯山，东为甘肃之北山山地。吐鲁番-哈密盆地，地形相连，中间仅以沙山相隔。由于盆地的特殊自然环境，使其成为历史上着名的产棉区和瓜果之乡。盆地内，沙丘和风蚀地貌仅有零散分布，旦多集中于盆地南侧，对于盆地内的交通，未造成难以克服的障碍，因而成为东汉以来中原前往西域较理想之通道。《后汉书西域传》云：“自敦煌西出玉门、阳关，涉鄯善，北通伊吾千余里，自伊吾北通车师前部高昌壁千二百里，自高昌壁北通后部金满城五百里。此其西域之门户也，故戊己校尉更互屯焉。伊吾地宜五谷、桑麻、蒲萄。其北又有柳中，皆膏腴之地，故汉常与匈奴争车师、伊吾，以制西域焉。”这段记载有两点错误：一、伊吾位于今哈密境，置屯田后，玉门关北通伊吾的路线，既可避三陇沙、白龙堆之险，道路又较直捷，绝无可能向西南至鄯善，再北经罗布淖尔北岸之白龙堆，越库鲁克塔格山脉，向东北至伊吾的道理。二、车师前部治交河域，戊己校尉治高昌壁，柳中在高昌壁东南，其位置均在伊吾之西，故伊吾至车师前部的道路应向西行。但是，这段记载尽管有上述错误，仍然真实地反映了东汉王朝对吐鲁番-哈密盆地战略位置的认识，记述了东汉玉门关至车师前、后部的道路。
关于这条道路，还可自窦固进击匈奴的行军找到线索。据《资治通鉴东汉明帝纪》，永平十五年(公元72年），命窦固、耿秉、耿忠等议击匈奴事。耿秉议曰：“当先击白山，得伊吾，破车师，通使乌孙诸国以断其右臂；伊吾亦有匈奴南呼衍一部，破此，复为折其左角，然后匈奴可击也。”又据《后汉书窦固传》、《后汉书耿秉传》，永平十六年(公元73年），窦固、耿忠“率酒泉、敦煌、张掖甲卒及卢水羌胡万二千骑出酒泉塞，至天山，击呼衍王”，“呼衍王走，追至蒲类海，留吏士屯伊吾卢地”。十七年(公元74年)夏，“复出玉门击西域”。耿秉“议先赴后王，以为并力根本，则前王自服”，“乃上马，引兵北入”。后王降，“其前王亦归命，遂定车师而还”。从窦固两次进击西域的路线看，大体是遵循耿秉的建议的。第一次出击，自酒泉塞西北出，经北山山地、哈尔里克山北，至巴里坤湖。返回时，经哈尔里克山口南至伊吾，于此留兵屯田，以作进军车师的前进基地，大军则南人玉门关。第二次出击，出玉门北至伊吾，折西北，经哈尔里克山与博格达山山口出天山，折西至务涂谷(今吉木萨尔南），然后南经博格达山山口至交河城，再东返伊吾而还。窦固东返的路线，即上述《后汉书西域传》所载的路线。
但《后汉书西域传》记载，东汉北道始自车师。《魏略西戎传》记载新道的路线，亦未北经伊吾。《隋书裴矩传》云发自敦煌，至于西海：凡为三道……其中道从高昌、焉耆、龟兹、疏勒，度葱岭，又径钹汗、苏对沙那国、康国、曹国、何国、大小安国、穆国，至波斯，达于西海。”仅隋代北道，即经由天山北路达于西海的道路，始北经伊吾至蒲类海。《元和郡县图志》云：“玉门故关，在(敦煌)县西北一百一十七里。谓之北道，西趣车师前庭及疏勒。此西域之门户也。”又，《周书异域传高昌国》云自敦煌向其国，多沙碛，道里不可准记，唯以人畜骸骨及驼马粪为验，又有魍魉怪异。故商旅来往，多取伊吾路云。”据此可证，自东汉至隋，由玉门关至车师前部(高昌)的道路，均多取捷径，向西北，经沙碛，至车师；而不取北经伊吾，再折西至车师的路线。《后汉书耿恭传》载，明帝永平十七年(公元74年），以谒者关宠为戊己校尉，“屯前王柳中城”。又，《后汉书班勇传》载，班勇曾向朝廷建议，“宜遣西域长史将五百人屯楼兰，西当焉耆、龟兹径路”。但由于西经故楼兰的西汉北道渐被堙废，东汉的路线改向西北，由玉门关经柳中至车师的新北道已经开辟，故班的建议终未被采纳，而于安帝延光二年(公元123年），以班勇为西域长史，“将兵五百人出屯柳中”。又，《元和郡县图志》云：“柳中县，当驿路，城极险固”。由此可知，经由柳中的新北道，为东汉时的主要交通干线。这条路线，早在西汉即已有人提出。《汉书西域传》云元始中，车师后王国有新道，出五船北，通玉门关，往来差近，戊己校尉徐普欲开以省道里半，避白龙堆之厄。”但由于当时尚不具备开辟此道的政治条件，故延至东汉始正式开通。
至于东汉北道的具体路线，据《魏略西戎传》的记载，“从玉门关西北出，经横坑，避三陇沙及龙堆，出五船北，到车师界戊已校尉所治高昌，转西与中道合龟兹”。故自小方盘城西出后，应经临要燧(111，1）20)、018(1)，折向西北，渡疏勒河，经何黑咀井，折向北，经红柳井子，直向北，经东盐湖西，达噶顺戈壁(《大慈恩寺三藏法师传》称“莫贺延碛”)南侧，沿碛南之突出山、龙头山，转西北至鄯善(即辟展），径兰干至髙昌。“横坑”“五船”今不可考。“横坑”，或即今哈密以南之东盐湖洼地。“五船”，徐松《汉书西域传补注》卷下云：“今小南路有小山五，长各半里许，顶上平而首尾截立，或谓之五船也。”此说不确。清代之小南路，乃哈密往西北，经头堡、二堡、三堡、一湾泉、七角井，折西南，经东、西盐池、七克腾木、鄯善至吐鲁番的道路。另有南路，由哈密经三堡，西南行，经四堡、五堡、十三间房，沿噶顺戈壁北缘，经鄯善、鲁克沁至吐鲁番。此两路均为《周书异域传》所称之“伊吾路”。东汉之北道既不经伊吾，其道当更偏南，故“五船”不当在小南路。按，“五船”乃对“雅丹”地貌之形象称呼。“雅丹”地貌在正当风口处，多作长条形分布，顶上平而四周截立，形象似船。故“五船”或指鄯善以南之风蚀沙丘地，唐称“大沙海”，宋称“大患鬼魅碛”，今称“库木塔格”者。玄奘、王延德均经由此砂碛以北抵高昌。东汉北道似亦绕道此沙碛之北。鄯善，清代名辟展，《魏书高昌传》称“白棘城”，《大慈恩寺三藏法师传》称“白力城”，《王延德行记》称“宝庄”。《汉书西域传》和《魏略西戎传》所称“五船北”，或指同一地点。
据黄文弼《吐鲁番考古记》，于今吐鲁番盆地南部艾丁湖北岸，有一东西向古道，自鲁克沁东南之得格尔，经穷阿萨、乌盘土拉、毕占土拉、卜柯洛克土拉、阿萨土拉，至屋威梯木，转西南至托克逊。沿途有古时营堡遗留之土墩。“土拉”，即突厥语土墩之义。在卜柯洛克土拉旁有古渠，东西环绕，墩后有塘，距墩二、三里有古时田亩遗迹，疑为古时屯田之所。此东西行古道，或为汉唐以来通西域之大道。凡高昌往龟兹者，由得格尔西北行，经鲁克沁、洋海、高昌、交河城，转西南行，经布干土拉、大墩子、屋威梯木、托克逊、苏巴什、库米什、乌什塔拉、和硕、焉耆，出哈拉沟(唐代之铁门关位于此），经库尔勒、库尔楚气与西汉北道合，经野云沟、策大雅、轮台，至龟兹。若由得格尔径直经焉耆往龟兹者，则直西行，至屋威梯木，与交河至托克逊之大道汇合。唐时称“银山道”。此道在得格尔以东，似东南行，绕库木塔格南，于阿齐山附近折向东，与经由“五船北”的道路汇合。故此道较经“五船北”的道路更直捷。盖戈壁平野，歧路纷纭，行旅为取便捷，多任自选择。但上述两道多临风戈壁，地少水草，行旅艰难。故《北史西域传高昌国》云自敦煌向其国，多沙碛，茫然无有蹊径，欲往者寻其人畜骸骨而去。路中或闻歌哭声，行人寻之，多致亡朱，盖魑魅魍魉也。故商客往来，多取伊吾路。”“伊吾路”，如前所述，东汉即已开辟，唯未成为主要交通干线，且均南行至敦煌。自伊吾向东南至晋昌玉门关的道路，大约于北朝前后开辟。隋时玉门关东迁，故《隋书北狄传西突厥》云：“处罗大败，弃妻子，将左右数千骑东走。在路又被劫掠，遁于高昌，东保时罗漫山Q高昌王麴伯雅上状。帝遣裴矩将向氏亲要左右，驰至玉门关、晋昌城。”可知此时之玉门关巳东迁至晋昌县境。按，晋昌即今甘肃安西县苦峪城遗址，唐玉门关遗址位于今安西县双塔堡。
东汉南道与西汉无大变化。但此时，玉门关与阳关的道路，已各有特定走向，出玉门关者为北道，出阳关者为南道。
综上所述，可知《魏略西戎传》所载之新道，实为东汉之北道；中道实为西汉之北道。故黄文弼先生认为，《汉书西域传》所记人西域的道路，实为东汉的路线，此意见似有一定道理。但《魏略西戎传》所载入西域的三道，为魏晋时期的路线，由于疏勒河以北之政治形势发生变化，原绕道湾窑、哈拉齐之路线，巳无必要。故中道虽为西汉之：lC道，但于都护井至居卢訾仓段，走向已有改变。“都护井”似即榆树泉。由榆树泉西北行，渡疏勒河，经戈壁和风蚀台地群(亦即陈宗器先生所称之“迈赛群”），至库姆塔格沙漠北部突出部，与西汉北道合，然后至居卢訾仓。此道较西汉北道省一半路程。这条道路正是陈宗器先生当年所经的路线。
魏晋南道，为避三陇沙之险，移往库姆塔格沙漠以南。经实地调查，于今敦煌南之崔木土沟南，与汉南道分歧，经葫芦斯台、安南坝，沿河尔金山北麓，过红柳沟口，至米兰，转西南至若羌。这条道路即陶葆廉《辛卯侍行记》卷5所称之“汉南道”。因此道经婼羌北境，故《魏略西戎传》称“经婼羌转西”。自魏晋以来，为河西入南疆之捷径。唐代玄奘、岑参由南道至敦煌，均取道于此。
