不久罗勃特康复，再投入战斗。1864年11月，北军在维吉尼亚的罗雷尔山之役（WarofLaurelHill)兵败，罗勃特受伤被俘，12月5日死于俘虏营中，后被葬于盖兹堡（Gettysburg)军人公墓。李文斯顿听到消息后非常难过，他写道：“我现在如果还年轻，也会加人林肯的北军，为解放黑奴而战。”
李文斯顿的第二个儿子多马，从小就有肾病，身体不好，但是也喜欢旅行探险，后来在26岁时，病逝于埃及。三儿子奥斯维尔，后来成为杰出的科学家，担任英国皇家地理学会的主任秘书。大女儿艾格妮丝后来嫁给布鲁斯（AlexanderL.Bruce)，继续父亲拯救与扶持非洲土著的工作。小女儿安娜后来嫁给威尔逊（FrankWilson)’成立深海渔民协会（DeepSeaFishermanSociety)，向渔民传福音。夫妇俩也成为海外宣教士，到非洲狮子山共和国(RepublicofSierraLeone)传福音。
研究人不等于爱人
李文斯顿回国后，才发现伦敦宣道会已濒于解体危机中，不只是支持海外宣道的奉献经费锐减，而且海外布道受到许多的责难。李文斯顿前去辩论，当时的人类学家科伦索（Dr.Colenso)博士提出：“传福音给非洲土著是破坏他们的传统文化。”李文斯顿立刻答道：“你的论点仿佛尊重土著的传统文化，其实是不爱现今活在非洲大地上受苦土著的生命。”这是人类学家与考古学家很容易堕入的陷阱，将土著的现今生活与过去的文化剥离，甚至用学术之名，期待僵化现今的土著生活，去满足他们的研究环境，而从来不去爱护与关怀现今土著的生活。
法国文学在当时非常流行，有个前卫的法国诗人在演讲中就提到：“海外宣道是一种荒谬的谎言，以西方先进去欺骗愚昧的土著。”李文斯顿的答辩非常精彩，他答道：“海外布道是帮助土著的心灵，除非你不相信土著有心灵的存在，不然你必须肯定福音对土著心灵的帮助。而且你的论点的前提是认为土著比较愚昧，我认为你这是侮辱土著的尊严。自认站在文明髙阶的人，应该走下你的台阶，与土著站在相同水平的台阶上，看他们是如何地被西方的经济扭曲。”
倒果为因的错误
也有人声称：“海外布道不过是满足英雄式的个人崇拜。”李文斯顿立即提出：“当海外宣教士在大沙漠中濒临渴死，或迷失在森林中濒临饿死，即将渴死或饿死之人有什么英雄形象？那种惨状有什么值得崇拜？那是信心的极限，不断仰望上帝‘将今日的饮食赐给我们’。”
当时更有神学家提出：“根本不用去海外传福音，只要经历长久的时间，福音自然就会逐渐传出去。”李文斯顿却提出：“收庄稼是收割者的责任，传福音是基督徒的责任，不是‘时间’与‘自然’的责任。”
濒临解体的伦敦宣道会已经无法支持李文斯顿再进人非洲，英国政府想资助他。不过由于上一次的经验，李文斯顿拒绝英国政府的经费支持。
尼罗河集水区之谜
迷人的大河
1865年1月5日，李文斯顿收到英国皇家地理学会会长莫金森爵206士（SirRoderichMurchison)的来信，请求他探测尼罗河的集水区，并且答应支付探险费用2000英镑与他孩子的生活和教育费用。
尼罗河是世界上最长的河流，有6650公里长，发源自非洲内陆，流经卢旺达（Rwanda)、乌干达、埃塞俄比亚（Ethiopia)、苏丹（Sudan)、埃及（Egypt)后，流入地中海。这条河流自海口可以上溯3200公里，以后就遇到湍流难以上溯。尼罗河孕育了世界上最古老的文化——古埃及文化，许多古书都曾提到这条河流。尼罗河的流量非常的大，而且终年不枯竭。在埃及与苏丹境内，年降雨量只有25厘米，如果没有尼罗河的给水灌溉，几乎是沙漠一片。那么，尼罗河的水量是从哪里来的？
维多利亚湖
尼罗河在苏丹境内分为两道支流，东边的支流河道较短，称为蓝尼罗河（BlueNile)。1613年西班牙教士贝以日（PedroPaez)发现，这条支流源自埃塞俄比亚高原，高原的降雨量较多。尼罗河西边的支流较长，称为白尼罗河（WhiteNile)。1860年英国探险家史毕其（JohnHanningSpeke)自埃及沿着陆路南下，到达一个大湖，将之命名为“维多利亚湖”（LakeVictoria)，以纪念英国女皇。维多利亚湖是非洲第一大湖泊，湖水自南向北流人白尼罗河，史毕其认为这湖是白尼罗河的发源地。
1862年，探险家伯顿爵士（SirRichardBurton)在维多利亚湖南端又发现一个大湖——坦噶尼喀湖。这是世界上最长的淡水湖，长700公里，面积有33000平方公里，是非洲第二大湖。这湖泊里有世界上最大的淡水鱼——尼罗河鲈鱼（NilePerch)，重达45公斤以上。水中也有一种稀有的剧毒眼镜蛇。
非洲水源的命脉
1864年4月，英国探险家贝克爵士（SirSamuelWhiteBaker)发现爱伯特湖（LakeAlbert)，这湖长150公里，宽35公里，位于白尼罗河的西边，湖水也流入白尼罗河。因此白尼罗河的水源是来自东边的维多利亚湖与西边的爱伯特湖。但该地区的年平均降雨量只有1270厘米，因此这两大湖在非洲内陆中心应该还有一个广大的集水区，才能供给这两个大湖的水量，而这集水区是否也与坦噶尼喀湖的集水区有相互的关联，外界没有人知道。水是整个北非、东非与中非的命脉，这个集水区应该就在非洲的内陆，而最了解这地区的就是李文斯顿。
1865年1月7日，李文斯顿回信道：“我继续往前，是为了到未知之地布道，而不是为了地理科学的探知。”他拒绝皇家地理学会的捐助，但是他答应进人该地。他在日记中写道：“布道是我的责任，探险是为了接触更多的土著，地理侦测只是传福音的切人点。”基于上次赞比西河探险的经验，李文斯顿要求独立作业，不受皇家地理学会任何的支配。英国皇家地理学会与世界各地的探险队员皆知，这是极为危险的任务，未知的土著、残暴的原始种族、冷血的奴隶贩子、致命的瘟疫、泛滥的河水、野生动物的攻击，一进人那地方，即与外界文明世界完全隔离，普世除了这位海外宣教士，任何人进入该地其实都是项“自杀任务”。
李文斯顿布遒基金
李文斯顿希望柯克与他同去，但是柯克刚结婚，无法同行。李文斯顿决定独自率领非洲土著进人。李文斯顿的老友杨格在苏格兰登高一呼，募集了3000英镑，成立了“李文斯顿布道基金”，支持他到未知之地设立布道所。
4月15日，李文斯顿出版他的第二本书《赞比西河与其支流》(TheZambezianditsTributaries)著名的生物解剖学教授欧文看了这本书后写道：“李文斯顿的旅行记录，将成为自然科学史上不朽的著作。这本书不同于一般的旅行记录，他将旅行当成撒种之旅，努力且持续地将生命的种子撒在非洲土著的心田里。也许在他有生之年看不到撒种的效果，不过这显示在他非洲之旅的背后，对上帝有独特的信心。他书中描述非洲的见闻，自然科学的研究，周遭环境的观察，像是给读者一篇又一篇单纯、细腻的讲道……在每一个仇恨之处，看到了赦免；在人与人的猜忌之处，看到了信任；在虚谎的陷阱中，看到了承诺；在行为败坏之处，看到了高贵。没有一本旅行记录，记录了这么多旅行者与当地人在真理与爱里的互动。所有把人生当成一场探险之旅的人，都应该看看李文斯顿所做、所说、所写的，它像是一个指南针，准确指出正确的方向。
非洲音乐学校
这本书在出版一周之内，就卖出了5000本。李文斯顿将售书所得，在银行里设立了一个教育孩子的专户基金。李文斯顿在这书中，也提到想在非洲成立一所音乐学校，让土著以自己的乐器与风格，去表达非洲的音乐。李文斯顿后来在印度将“玛罗勃特”号汽艇售得的2300英镑，与在印度的基督徒所捐的3700英镑，一同存在银行里，准备成立这所非洲音乐学校。没想到后来这间银行因经营不善倒闭。在银行业者的眼中，李文斯顿不过损失了6000英镑，但是非洲音乐学校的美好理想，与培育非洲音乐人才的机会却被葬送了。
写书与出书之外，李文斯顿所有的时间都与家人在一起，他带孩子去爬山钓鱼，逛博物馆，参观动物园，听音乐会。他的女儿艾格妮丝后来回忆道：“父亲经常带我去钓鱼，我常想他如果没去当海外宣教士，他将会是英国最会钓鱼的人。”小女儿安娜也回忆道：“父亲给我最珍贵的礼物是一个黑色的洋娃娃。当我抱着洋娃娃到学校时，同学们都笑我的洋娃娃不是白色的。我在成长时期常想，为何父亲送我这么特别的洋娃娃？我想我后来明白了。”
6月19日，李文斯顿的母亲病逝。8月19日，李文斯顿才离开英国，前往非洲寻找尼罗河的集水区。离家前，李文斯顿为孩子们祷告：“无论你们一生遭遇任何事，愿上帝的大能保守你们，使你们成为周遭人的祝福。愿上帝使你们恨恶一切的无聊与虚伪，并成为优秀的人，以助人为乐。当你们为此祈求时，愿上帝将更多的赐与你们，愿主祝福你们。”
